免疫熒光技術(shù)基本原理
免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展zui早的一種免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展zui早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)（fluorescentantibodytechnique）。
用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因?yàn)闊晒馍夭坏芘c抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測(cè)或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測(cè)或定位抗體，但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。

該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完*，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。
熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡(jiǎn)便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。
由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。近年來發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定，與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。

1．原理　
免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。
直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。
間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（*抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為*抗體，其它步驟的抗原檢查相同。
標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于雞任何抗原的診斷。

2．技術(shù)分類：
⑴ 熒光抗體技術(shù)(熒光顯微鏡技術(shù))
抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測(cè)方法。

⑵ 免疫熒光測(cè)定技術(shù)：
抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測(cè)定熒光強(qiáng)度而推算被測(cè)物濃度的檢測(cè)方法-
（1）熒光物質(zhì)
1）熒光色素
許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：
(1)異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，zui大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，zui大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：
有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用zui廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。
(2)四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下：
zui大吸收光波長(zhǎng)為570nm，zui大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm，呈橘紅色熒光。
(3)四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：
zui大吸引光波長(zhǎng)為550nm，zui大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。

（2）其他熒光物質(zhì)
1）酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基苯乙酸等。
2）鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3 ）、鋱（Tb3 ）、鈰（Ce3 ）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應(yīng)用zui廣。
螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，用于分辨熒光免疫測(cè)定。" j/ I" J: F; N

（3）常見熒光素：
1）FITC
2）RB200
3）TRITC2
4）鑭系：Eu、Tb
5）PE
6）其它
常見熒光素的特性：
1）FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490~495nm，發(fā)射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。
2）RB200： 橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光 595~600nm，橘紅色熒光。
3）TRITC： 紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光 620nm，橙紅色熒光。
4）鑭系：Eu、Tb
5）PE：吸收光490~560nm，發(fā)射光 595nm，紅色熒光。
6）其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。
酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)：
酶 底物 產(chǎn)物 激發(fā)光 發(fā)射光
MUG MU 360 450
MUP MU 360 450
HRP HPA 二聚體 317 414

（4）合適熒光素的選擇
1）具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。
2）熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯。
3）熒光色澤與背景色澤對(duì)比鮮明。
4）標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性
5）標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、快速。
6）安全無毒